EVDE VE OKULLARDA HOBİ AMAÇLI BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ

Doç. Dr. Mehmet Babaoğlu
Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi, 42079 Kampüs, Konya
Tel&Fax: 0332 2513564
mbabaogl@selcuk.edu.tr

Özet

Bitki biyoteknolojisini oluşturan iki unsur olan bitki doku kültürü ve bitki genetik mühendisliği hem ticari hem hobi hem de araştırma bazında rutin olarak uygulanmaya başlanmıştır. Bitki doku, hücre veya organlarının laboratuvarda kontrollü ve steril şartlarda çeşitli besin ortamlarında kültüre alınması, onlardan yeni hücreler, dokular, organlar veya yeni bitkiler üretilmesi işlemlerinin tütüne birden bitki doku kültürü denilmektedir. Genellikle bitkilerin yaprak, gövde veya köklerinden alınan parçalarındaki vücut hücrelerinin özel besin ortamlarında kültüre alınması yoluyla uygulanır. En çok karşılaşılan uygulama hücrelerde, o hücrelerin alındığı bitkiye benzer bitki veya bitkiler üretmektir. Buna rejenerasyon denilir. Ayrıca tek başına hücreler veya organlar (örnek: kökler) çoğaltılabilir ve çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Bu işlem bitkilerin amaca uygun olarak genetik yönden değiştirilmesine de imkan sağlamaktadır.

Bu yayında amaç evlerde, lise ve dengi okullarda veya üniversite lisans seviyelerinde bitki doku kültürüne ilgi duyanlara doku kültürünün temel mekanizmasını anlatmak, basit doku kültürü tekniklerini kendilerinin uygulayabilmesi açısından açılımlar getirmektir. Evde bu işlemleri yapanlar hem kendilerine iyi bir vakit geçirme, hem de istedikleri bitkileri çoğaltabilme imkanı sağlayacak, ilköğretim çağında olan öğrenciler bitkilerin üreme, çoğalma ve büyümesi ile ilgili bilgileri kendilerinin deneyerek öğrenmelerini sağlamaktır. Ayrıca burada bahsedilen teknikler ticari amaçlı olarak üretim yapacaklara da kısmen ışık tutabilir. Daha geniş bilgi almak isteyenler Bitki Biyoteknolojisi Cilt I Doku Kültürü ve Uygulamaları (M. Babaoğlu, E. Gürel, s. Özcan; Editörler, Selçuk Üniversitesi Yayınları, 2001) alı kitaptan faydalanabilirler.

1. Giriş

Bitki doku kültürü; aseptik (steril) şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları=eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir (Babaoğlu ve ark., 2001). Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik çeşitlilik oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır.
Bitki doku kültürü ile ilgili önemli çalışmalar Tablo 1’de verilmiştir.

Tablo 1. Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar (Babaoğlu ve ark., 2001).

[ATTACH]28[/ATTACH]

Bitki biyoteknolojisi doku kültürü ve genetik mühendisliği olarak 2 unsurdan oluşmaktadır. Aslında Tablo’dan da görüleceği gibi biyoteknoloji yeni bir kavram değildir. 1950'li yıllarda Hoagland ve Arnon "Hoagland Çözeltisini" geliştirerek bitkilerin topraksız ortamda da büyüyebileceğini göstermelerinden sonra, bu çözelti azot, fosfor, potasyum, mangan, demir, bakır, çinko, bor, magnezyum, kükürt, kobalt gibi bitkiler için önemli olan 11 adet mineral tuz içermekteydi. Uzun yıllar su kültüründe (hidrofonik) sebze yetiştirmede kullanılmış ve hala topraksız tarımda kullanılmaktadır.

Bitkilerin laboratuvarda veya kontrollü şartlarda fazlaca miktarda çoğaltılması (mikro çoğaltım, klonal çoğaltım) klasik usullerle bitki üretimine önemli bir alternatiftir. Mikro çoğaltma çevre ve besin kontrolü yapılabilen steril (mikroorganizma, toz vb. ihtiva etmeyen) yetiştirme şartlarında bir bitkinin tomurcuk, boğum, yaprak ve kök parçaları gibi çeşitli yerlerinden alınan küçük parçalarının (eksplant) kültürü sonucu yeni bitkilerin üretilmesidir. Üretilen bitkiler her bakımdan birbirinin aynısıdırlar. Yani yapılan bu iş bitki klonlaması veya genetik kopyalamadır.

Normal olarak bilimsel araştırma laboratuvarlarında doku kültürü ile bitki üretimi için genellikle pahalı aletler kullanılır. Fakat bu yazıda bu aletlerin yerine çarşı ve pazardan kolaylıkla elde edilebilecek sıradan ev aletleri kullanılarak doku kültürü yoluyla istenilen bitkilerin çoğaltılmasının nasıl yapılabileceği konusunda ilgililere (evde hobi olarak veya ilköğretim okullarında) bazı bilgiler verilmektedir. Burada amaç konu ile ilgili kişilerin normal olarak evde saksılarda veya bahçelerinde yetiştirdikleri, özellikle süs bitkilerinden, istedikleri anda ve kısa zamanda çok sayıda yetiştirebilmeleri için gerekli bilgileri sağlamaktır. Bu çalışmalar hem vakit geçirme hem de değişik bitkilerin üretimi ve çoğaltılmasında bilgi sahibi olmak açılarından faydalı olacaktır. Ayrıca ticari amaçlı süs bitkileri üretimi yapanlara da bazı hususlar bakımından ışık tutabilir. Son kısımlarda doku kültürü ile ilgili daha fazla teknik bilgi verilmiştir. Bu çalışmalar biraz daha fazla teknik bilgi, maliyet ve dikkat gerektirmektedir.

2. Doku kültürü için gerekli şartlar ve aletler

a) Dikkat edilecek en önemli husus temiz (steril) şartlarda bu işlemlerin yapılmasıdır. Bilimsel çalışmalarda genel olarak steril yatay hava akışlı kabin denilen bir ekipman kullanılır. Fakat ev şartlarında bir balık akvaryumu veya 50x40x40 cm ebatlarında silikonla izole edilmiş veya kenarlarından iyice yapıştırılmış, sadece bir cephesi açık cam bir kabin aynı işi görebilir,

b) Alet ve ekipmanları, besin ortamlarını, su, kağıt, havlu vb. diğer kullanılacak malzemeleri steril hale getirmek için basınçlı pişirici (30-40 cm çapında düdüklü tencere),

c) Bir litre ölçebilen ölçü kabı, yiyecek kabı ve kapaklı cam kavanozlar (100-200 ml reçel veya konserve kavanozları uygundur. Kapağı ile düdüklü tencerede ısıtıldığında ısıya dayanabilmelidir),

d) Keskin ağızlı bıçak (bisturi) ve pens,

e) Eczanelerden temin edilebilecek enjektör (1-5-10-25-50 ml) ve medikal malzeme satıcılarından elde edilebilecek 0.2 mikrometre delik çapında selüloz nitrattan yapılmış filtreler (Millipore). Bunlar ısı ile bozulabilen maddeleri içeren solüsyonların (örnek: Hindistan cevizi sütü, deniz yosunu özü, bitki ekstraktları vb.) sterilize edilmesinde kullanılacaktır. Kabin içinde steril enjektöre sıvı çekilir, ucuna steril bir filtre takılır ve yine steril kavanoz içine bastırılarak süzülür,

f) Alüminyum folyo ve 10x10 cm ebadında seramik fayanslar (3-4 adet). Bisturi, pens ve fayanslar folyo içine sarıldıktan sonra tencerede kaynatılarak sterilize edilir. Bitki parçalarını kesme işlemleri ise, folyo kabin içinde açıldıktan sonra fayans üzerinde yapılır,

g) Etil alkol içeren ispirto lambası (Metil alkol kullanmaktan sakının, zehirlidir).

h) %70’lik alkol solüsyonu (70 ml alkol 30 ml su ile karıştırılır) içeren sprey şişesi. Transfer kabinin içi ve diğer yüzeyleri temizlemek için kullanılır,

i) Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu için ticari olarak satılan çamaşır suyu (genellikle %50 sodyum hipoklorit içermektedirler ve %10 ‘luk solusyon hazırlamak için 20 ml çamaşır suyu 80 ml su ile karıştırılır),

j) Kauçuk eldivenler ve herhangi bir deri dezenfektanı (Eczanelerden temin edilebilir),

k) Besin ortamlarının hazırlanması için de aşağıdaki yolları izleyiniz.

3. Besin ortamlarının hazırlanması

Kullanılacak maddelerin çoğu eczane, market, kimyevi gübre veya medikal malzeme satıcılarından temin edilebilir. Aşağıdakiler yaklaşık 1 litre temel besin ortamını hazırlamada kullanılır:

İki su bardağı yağmur suyu veya saf su (kaynatılmış ve soğutulmuş su da olabilir),
Çeyrek su bardağı toz şeker (yaklaşık 30 g.),
Gübre stok solüsyonu (bir yemek kaşığı 20:20:20 NPK gübresi 2 litre suda eritilir ve buradan bir bardak dolusu solüsyon kullanılır),
Eczanelerden alınabilecek 500 mg’ lık inositol tabletlerinden yarım tablet ve Thiamin’li vitamin tabletlerinden ½ tablet (Multi-vitamin tabletleri de kullanılabilir),
Medikal malzeme satıcıların temin edilebilecek ve besin ortamını yarı-katı (jel) hale getiren agardan dört yemek kaşığı,
Ampisilin içeren antibiyotik tabletleri (250 mg)
Sitrik asit (sirke asidi) ve sodyum bikarbonat (Kabartma tozu)

Ağzı kapanabilen bir kaba önce su ve sonra bütün maddeler ilave edilerek karıştırılır. Besin ortamı pH’sı dar alalıkta renk değişimi ile pH’yı tahmin etmeye yarayan indikatör kağıtlarla ölçülür ve 5-6 arasına ayarlanır. Eğer pH fazlaysa sitrik asit, düşükse bikarbonat soda kullanılarak ayarlanmalıdır. Daha sonra agar ilave edilerek eriyinceye kadar ocakta sık sık karıştırarak kaynatılır. Daha sonra eriyik kavanozlara ¼ (çeyrek) oranında veya 2 cm kalınlıkta doldurulur. Basınçlı pişirici içine önce 1/5 oranında su, üzerine ayaklı bir sehpa (metal) konulur, sterilize edilecek malzemeler bu sehpa üzerine konulduktan sonra kavanoz kapakları gevşek olarak kapatılır ve tencerede buhar çıkmaya başlamasından itibaren 15 dakika süreyle tutulur.

Bitkileri çoğaltmak ve köklendirme ortamlarını hazırlamak için yukarıdaki ortama yarım bardak Hindistan cevizi sütü ve malt ilave edilir. Hindistan cevizi sütü yerine yarım bardak yeşil domates püresi veya yarım bardak taze sıkılmış portakal suyu da kullanılırsa ilginç ve farklı sonuçlar ortaya çıkabilir. Ayrıca yarım çay bardağı organik deniz yosunu özü ilave edilebilir (Örnek: Kelpak).

4. Alet ve ekipmanların sterilizasyonu

Bistüri ve bıçaklar alüminyum folyo içine sarılarak basınçlı tencerede 15 dakika kaynatılarak steril hale getirilebilir. Bu aletler aynı zamanda ticari olarak satılan klor içeren bir çamaşır suyu içine batırılarak (15-20 dakika) veya alkol içine batırıldıktan sonra aleve tutularak (dikkatli olunuz!) da sterilize edilebilir. Bitki materyallerinin durulanmasında steril su, çalışma yerinin silinmesinde steril bezler kullanılmalıdır. Çalışmaların tamamı kabin içine serilecek steril bir bez veya steril bir fayans üzerinde de yapılabilir. Su, cam şişe veya kavanozlar içinde, kağıt veya bezler ise bir kese kağıdı veya otoklav naylonu içinde yukarıdaki metodla steril hale getirilebilir. Kese kağıdı kullanılırsa, tencereden çıkardıktan sonra ıslak durumda olduğundan 80 0C ye ayarlanmış bir mini fırın içinde kurutulmalı ve kullanılıncaya kadar açılmamalıdır.

Doku kültüründe kullanılacak malzemelerin ve besin ortamlarının sterilizasyonunda kullanılan basınçlı pişirici veya filtre sterilizasyonuna alternatif bir diğer yöntem de mikrodalga sterilizasyonudur. Çünkü özellikle filtre sterilizasyonu pahalı ve az miktarda ortam için uygun olmakta, basınçlı pişirici veya otoklavda sterilizasyon ise uzun zaman almakta ve sterilize edilecek malzemelere zarar verebilmektedir. 700 W gücünde bir ev mikrodalga fırınını kullanarak 3 g şeker içeren 100 ml (%3) besin ortamının 5 dakikada, 250 ml ortamın 10 dakikada ve 1 litre ortamın da 15 dakikada başarıyla sterilize edilebileceği bildirilmektedir (Babaoğlu ve ark., 2001).

Devamı sonraki mesajdadır...