Tweet
2.1.3.2. MİKRO (MİNİ) ÜRETİM TEKNİĞİNİN UYGULANMASI[5]
2.1.3.2.1. Kültüre Alınacak Türlerin Seçimi
Bazı kolay köklenen türlerde bu yöntem gerekli olmaz. Örneğin Kolyos, Da imi yeşil yapraklı Azelea'lar kolay köklendikleri için bu yöntemi uygulamaya lü zum yoktur. Buna karşılık ekseri koniferlerde bu yöntem henüz ticari olarak başarılı sayılmaz. Bununla beraber otsu bitkiler yanında ekseri odunsu bitkilerde de yöntem gittikçe yaygınlaşmaktadır.
Bu yöntemle hali hazır koşullarda üretilmesi başarı vadeden cinsler şöyle ve rilebilir:
Eğreltilerden Nephrolepsis, Platycerium, Pinacea'lardan Pinus (P. palustris), Sequioia spp., Araceae'lerden Anthurium spp., Syngonium spp., Lillaceae'lerden Asparagus spp., Lillum spp. Amaryûlidaceae lerden Amaryllis spp., Hypoxis spp., Iridaceae'lerden iris spp., Orchidaceae\&vdc\\ Cattleya spp, Cymbidium spp., Crassulaceae' lerden Kalanchoe spp., Rosaceae'lerden Amelanchier spp., Malus spp., Prunus spp., Rosa spp., Vıtaceae'lerden Vitis spp., Begoniaceae'\er- den Eucalyptus spp., Ericaceae'lerden Rhododendron spp., Vaccinium spp., Pri- mulaceae'\erden Primula spp., Gesneriaceae lerden Saintpaulia spp., Composi- tae' lerden Gerbera spp., Chrysanthemum spp.
Hernekadar bazı konifer türleri bu listede yer almakla beraber genelinde ko- niferler uygulamada henüz ticari anlamda başarılı sayılacak durumda değildir.
Yukarıda başarılı türler olarak yer alan türler arasında özellikle Rhododendron kültürlerinde bu yöntem bugün çok genişletilmiştir. Briggs Nursery (U.S.A.) 200 kadar Rhododendron varyetesi üzerinde bu yöntemi programa almış ve kitle üreti mine başlamıştır (Resim: 202). Ayrıca aynı fidanlık Defne (Laurus montana), Ayı üzümü (Vaccinium corymbosum), Açelya spp., Süpürge çalısı (Calluna vulgaris), Coreopsis spp., Huş spp., Amelanchier spp., Prunus spp., Elma spp., Kiraz spp., Gül spp., Ispirye spp., Clematis spp., Fransız hibrit leylakları, Böğürtlenler, Liîhos- permum spp., Hypericum 'larda da doku kültürü yöntemleri uygulamaktadır.
Bu yöntemle üretilecek bitkiler için, ticari fidanlıklarda seçilecek türlerin ay nı zamanda pazar potansiyeli bulunması, üretim maliyetinin satışlarla karşılana bilir olması, sağlık durumlarının kolay bir şekilde kontrol altına alınabilmesi ve nihayet sözkonusu türün tradisyonel üretiminin güç olması koşulları aranır ve an cak bu durumlarda bu yönteme başvurulur.
2.1.3.2.2. Çalışmanın Gerektirdiği Tesis ve Ekipmanlar
Laboratuvar tesislerinin büyüklüğü önemli değildir. Bu, çalışma kapasitesine göre ayarlanır.
Kurulması gereken tesisler üç gruba ayrılmaktadır. (Resim: 205) küçük bir kültür laboratuvarının planını içermektedir. Orta ve daha büyük kültür laboratu- varlan daha komplike bir düzen içinde kurulmaktadır (Bu konuda geniş bilgi Bkz. Kyte Lydianee)[6].
Laboratuvar tesisleri:
1. Ortam hazırlama odası.
2. Transfer odası.
3. Kültür büyütme odası
olmak üzere 3 ana üniteden oluşmaktadır.
Zorunlu durumlarda yahut geçici olarak bu üç hizmet aynı odada da biraraya getirilmektedir. Fakat uzun süreli çalışmalarda ve seri üretim yapılması ön görülmesi durumunda bu koşullar için, bu işlem yerlerinin daha sonra birbirinden ayrılması gerekir.
"Ortam hazırlama odası" bir mutfağa benzer. Sıcak ve soğuk suyu olan, bir lavabo, buzdolabı ve bulaşık makinesi gerekir. Bu odada daha sonra belirtilecek çok çeşitli besin tuzları, sakaros, bazı hormon, aminoasit ve agar gibi besleyici, köklendirici kimyasal maddeler, likit veya solüsyon halinde çeşitli ortamlar hazır lamak üzere bulundurulur. Hazırlanan ortamları ısıtma, karıştırma, dağıtma, ste rilize etme ve depolama işlemleri bu bölümde gerçekleştirilir.
"Transfer odası" kültür için steril bir ortam oluşturur. Bu ortama hava, yük
sek etkili partiküler hava filtrelerinden geçerek gi rer. Amatörce küçük ça lışmalar için bu işi, küçük ve basit bir kutu veya kap içinde yapmak da müm kündür (Resim: 206-3). Teknisyen onun içinde materyali böler ve diğer kaplara transfere hazır ha le getirir (Resim: 206-1, 2). Transfer odasında ay rıca depolama yerleri, otoklav, lavabo da uygun yerlere yerleştirilmiş ola rak bulunmalıdır.
"Kültür büyütme odası" ise sıcak, iyi ışık landırılmış raflara sahip bir odadır. Raflar tel ka fesler halindedir. Bu su retle hava sirkilasyonuna da en iyi şekilde imkan verirler. Rafların üzerine istenen ışık entansitesine göre belli bir yükseklikte yerleştirilen ve beyaz ışık veren Horasanlar konur. Bunlar belli bir zaman saatine bağlı olarak çalıştırılır. Yeni tekniklerde bu florasanlann yüksek sıcaklıklar oluş turması da engellenmektedir. Bu raflara kültür kaplan olarak kavanozlar veya tüp ler içindeki de büyümeye bırakılan bitkisel materyal parçalan (eksplantler) yer leştirilir. Kültür büyütme odasında dışa açılan pencereler olmamalıdır. Aksi halde yetişme ortamı koşullarının düzenlenmesi esnasında dıştan gelen ve zaman za man değişen ışık ve güneşin sıcaklık etkileri kontrol altına alınamaz ve stabil bir ortam yaratılamaz. Ayrıca elektrik donatımında daha önce belirttiğiniz gibi lam- balann yüksek sıcaklık vermeleri önlenmelidir. Zira kültür büyüme odasında 24- 29°C sıcaklık uygundur ve bu derece sıcaklıklar sıcak hava verilerek kontrol al tında tutulmalı ve sistem elektrostatik bir hava fılitresiyle donatılmalıdır. Kültür büyütme odasında günün 16 saatinde aydınlatma yapılarak bu otomatik olarak kontrol altına alınmalıdır.
Doku kültürü programının başarılı olması için her şeyden evvel yakın çevre nin de temiz bir yer olması istenir. Bunun için çevrenin beton ve asfalt kaplı, toz ve kimyevi kirlenmenin olmadığı bir yer olması gerekir. Bir bina, ofis veya sera nın bir kısmı bu işe ayrılabilir. Ancak bitişik odalarda bir bulaşma olasılığı bulun mamalıdır ve aynı zamanda kolay temizlenebilir bir yer olmalıdır. Başlangıçta amatör çalışmalar için bir mutfağa hava ceryanından etkilenmeyen bir yere bir kutu yerleştirip içi ışıklandırılmış raflarla donatılarak bir çalışma ortamı oluşturu labileceği belirtilmektedir. Ancak her şeyden evvel çeşitli kimyevi maddeler ve türlere göre birbirinden farklı ortamların hazırlanması konusunda bilgi sahibi olunması ve laboratuvar tekniğinin bilinmesi gerekir.
Ortam hazırlama, transfer ve kültür büyütme odalarının birbiriyle irtibatları ve ilişkileri (geçişler, kapılar, transfer) pencereler iyi ayarlanmalıdır. Transfer ve kültür büyütme odalarının özellikle dış kapılardan ve insanların çokça gelip geç tiği yerlerden iyi izole edilmesi lâzımdır. Laboratuvar, otopark, trafik yollan ve bunların toz, ekzos v.s. tesirlerinden en az etkilenecek şekilde yerleştirilmeli, et- raflannda çim sahalan ve hastalıklardan ari çalılarla temiz ve havadar bir mekan oluşturulmalıdır. Bina ve laboratuvarın temizliği bu yöntemin uygulanmasında esastır. Bakteri ve sporların kültüre havadan veya kap ve ekipmanlardan kolaylık la bulaşması mümkündür. Bu etkinin bir sterilizasyonla önlenmesi gerekir. Zira doku kültürü ortamlan bakteri ve sporlann gelişmesi için çok müsaittir. Bunlar kolaylıkla yeni bitkiye veya kültüre geçerek etkili olurlar. Ziyaretçilerin buralar da ayakkabılarıyla dolaşmalan dahi büyük sakınca yaratır. Ziyaretçiler ayakkabı larının üzerine plastik torbalar geçirerek içeri girmelidirler. Döşemeleri çok sık li- sollü su ile yıkamalıdır. Toz kaldırması muhtemel vakumlu alet ve süpürgeler bu tesislerde kullanılmamalı, yerler ve masalar lisol solüsyonlu süngerlerle her gün temizlenmelidir. Hiç olmazsa duvarlar ve ekipmanlar haftada bir kere dezenfek ten bir solüsyonla yıkanmalıdır. Transfer odasında ön kapak fılitresi 4 ayda bir de ğiştirilmeli, personel laboratuvar önlükleri ve saçları daima temiz tutulmalıdır.
Gerekli ekipmanlara gelince:
Başanlı bir çalışma için su ve onun kalitesi, özellikle kültür ortamları için çok önemlidir. Musluk suyu genellikle bazı erimemiş mineraller içerir. Bunlar kullanımdan evvel uzaklaştınlmalıdır. Aksi halde ortamda beslenme dengesini bozarlar. Su saflığı da zaman zaman ölçülmelidir. Su destilasyonunda uygun yön temler ve kombinasyonlan bilinçli olarak seçilmelidir.
Kimyevi maddeler ve ortam hazırlamada 2-4 mgr'lık hassas analitik teraziler bulundurulmalıdır.
445
Ortamların asiditeleri oldukça değişik olarak hazırlanmaktadır. Örneğin Rhododendron kültürleri için doku kültürü üretme ortamları 4.5-5.0 pH, Çileğin- kinin 5.7 pH olması istenir. Bu durumda pH ölçmeleri önemlidir ve dolay isiyle özellikle 2-9-8.0 pH arası değerleri hassasiyetle ölçebilen pH ölçerlere ihtiyaç vardır.
Kaplarda hazırlanan çeşitli ortamların ısıtılması ve karıştırılması için de çe şitli gaz ısıtıcıları ve mikserler, çalka makineleri gereklidir. Hazırlanan ortamı pi petlerle tüplere dağıtmada mekanik yöntem yerine otomatik dağıtıcılar kullanıla rak iş 5 misli daha süratlendirilebil- mektedir.
Tüp ve kavanozların sterilize edi ci otoklav ve benzeri ekipmanlardan geçirilmesi gerekir (Resim: 207).
Hazırlanan likit ortamını çalkala yarak yeterli bir kıvama getirebilecek santrfüj (rototar)lar ve bulaşık yıkama makineleri ile kimyevi madde ve or tam solüsyonlarını depolamak için (ki bunlar l-3°C'de saklanır) buzdolapla- rına gereksinim vardır.
Ayrıca doku kültürü yapılacak türlere bağlı olarak da bu çalışmaya uygun nitelikli bir mikroskopa da ihti yaç olacaktır. Meristem faaliyetinin başlamasını takip için bir tanımlama mikros- kopu da gereklidir. Rutin ve ticari işler için komplike bir mikroskopa gereksinim yoktur. Hatta alınan parçalar mikroskopik olmadığı zaman üretimde mikroskopa da gereksinim olmaz.
Ayrıca detaylı bir malzeme ihtiyaç listesinin 50'yi aşkın çeşitli malzeme ile hazırlanması da gerekmektedir (Bkz. Kyte s. 31-33)
Resim: 207. Tüp ve kavanozlar sterilize edici otoklavlardan geçirilir. Kyte, L. Plants from Test Tubes'den.
Kültür Ortamının Hazırlanması
însan ve hayvanlardaki somatik hücrelerin ve dokuların aksine bazı bitkisel hücreler (meristem hücreler) çoğalarak kök, gövde ve tepeye sahip yeni bir bitki yi oluşturabilme niteliğine sahiptir demiştik. Bu yeteneğe (totipotans olayına) da yanarak bazı bitki hücrelerinden in vitro ortamlarda fidan üretilebilmektedir. Bu
kültür ortamlarında "eksplant" denilen bitki parçaları bütün bir fidanı oluştura bilmektedir. Bu kültür ortamlarının hazırlanmasında inorganik ve organik çeşitli kimyasal maddeler kullanılmaktadır.
Kullanılan kimyasal maddeler:
Doku kültürünün gelişme yapacağı ortam büyük önem taşır. Ayrıca laboratu var çalışmaları ve kimya alanında yeterli bir birikime sahip olmak da gerekir.
Yetiştirme ve geliştirme ortamları çok çeşitli kimyasal maddelerden oluştu rulur.
Makro elementler olarak azot, fosfor, potasyum, sülfür, kalsiyum, maynez- yum ve demir gerekir. Bu makro elementler bitki beslenmesinde yapısal element lerdir. Bunlardan fosfor enerji metabolizmasında önemli rol oynar, magnezyum klorofil monoküllerinin oluşturulmasında, demir solunum ve fotosentezde, oksi- dasyon ve rediksiyonda etkilidirler. Kalsiyum ve magnezyum enzim sistemlerin de fizyolojik rol oynarlar.
Minör elementler olarak B (Bor), Mn (Mangenez), Co (Kobalt), Zn (Çinko), Cu (Bakır), C1 (Klor) sözkonusudur: bu minör elementler katalitik bir etkiye sa hiptirler.
Kullanılan ortamların pH'ları genellikle 4.5-5.7 pH arasında ayarlanır. Ortam çok asit ise NaOH ilavesiyle asidite azaltılabilir. Ortamın pH'ı yüksek ise Hcl ila vesiyle reaksiyon düşürülebilir.
Organik kimyevi maddeler olarak da; Sakaroz, tnesital, Thitiamin (B, vita mini içerikli), Nikotinik asit, çeşitli B vitaminleri ve kültürlerin enfeksiyonlara karşı korunması için bazı antibiyotikler de ortama katılmaktadır.
Ayrıca Auxinler, Cytokinin, Adenin, Gibberilin gibi çeşitli organik menşeli kimyasal maddelerin de türlere göre değişik oranlarda kullanımı gerekmektedir.
Esas itibariyle auxinleri içeren hormonlar kök durumunu teşvik ederken Cytokinin içerenler toprak üstü kısımlarının gelişimini hızlandırırlar.
Böylece doku kültürü için hazırlanan ortama çeşitli besin tuzlan, sakaroz, ba zı hormon, aminoasit ve hatta antibiyotikler dahil olmaktadır.
Oluşturulan gelişme ortamlannda Auxinler ve bazan da fenolamidler köklen- dirmede, gibberilin gövdeyi uzatmada ve gene gibberilin ve cytokinin tomurcuk ların çoğalmasında ve sürgünlerin büyümesinde etkin olurlar. Ortama giren bu maddeler ve yeni yeni araştırmalar zenginleştirilmekte, yenileri de ortaya çıkmak tadır. Bunlardan en son fenol amitler'in kullanımı 1970 yıllarında belirlenmiştir.
Çalışmalar zamanımızda daha da yoğunlaştırılmaktadır.
Ancak işin en çetin tarafı, üzerinde çalışılacak türe uygun ortamın araştırılıp, bulunup kullanılmasıdır.
Bu konuda çeşitli formüller kullanılmakta ve önerilmektedir. Bunlardan en süratli ve en yüksek sonucu verenler uygulamaya intikal ettirilmektedir. Bu çok çeşitli formüller son yıllarda bazı yayınlarda geniş ölçüde ele alınmaktadır.
Bunlar içinde süratli, kolay ve basit bir formül burada verilmekle yetinilecektir.
Bu formül şu maddeleri içermektedir:
1/8 kap (ölçek) kullandığımız şeker
1 kap musluk suyu
1/2 kap 10: 10: 10 oranlı NPK kimyevi karışık gübreden. 1 galon (3,8 İt) erimiş halde ha zırlanan eriyik
1/2 tablet Inositol (250 mg'lik) 1/4 tablet thiaminli vitamin tablet
2 çorba kaşığı agar
Eriyik agar yumuşayana kadar kaynatılmakta, karıştırılmakta ve büyütme ka vanozu veya tüpüne 1,25 - 2,5 cm kalınlıkta olacak şekilde konmakta, üzeri bir mantar veya kapakla kapatılmaktadır. Bundan sonra eriyik 15 pound basınç altın da 15 dakika kadar fırına konmaktadır. Bu arada kullanılan karıştırıcı ve pinset gi bi aletler de sterilize edilmelidir.
Hazırlanan depo solüsyonlar da buzdolabında depo edilir. Bu depo edilen solüsyonlar:
Majör ve minör tuzlar solüsyon halide
Vitaminler
Demir solüsyonu
Bengyladine solüsyonu
Indol 3 butric asit (IBA) solüsyonu
Gibberellic asit solüsyonu
olmak üzere herbiri kendi içinde belli nisbetlere göre hazırlanır. Örneğin majör ve minör tuzlara girecek birçok kimyasal madde belli oranlarda biraraya getirilerek bu tuz solüsyonu oluşturulur. Sonra bu depo solüsyonları türlere göre değişik oranlarda olmak üzere biraraya getirilerek ve hazırlanmış agarlı ortama ilave edi lerek büyüme ortamı hazırlanmış olur.
Bu ortam hazırlama işleri, belli bir türle çalışıp yeterli bir alışma süresi geçi rilmiş yerlerde nispeten kolay olmakla beraber bu işlemler oldukça uğraştırıcı ve laboratuvar deneyimini gerektirici işlerdir. Ancak son zamanlarda bazı hazır ortamların ortaya çıkmaya başlamış olması bu konudaki uygulamaların oldukça pratikleştirmesi ve yaygınlaşmasına yol açması beklenir
2.1.3.2.3. Mikro Üretim
Bir bitki türünün bu yöntemle çabuk üretilmesi istendiği zaman genellikle to murcuklardan alınan küçük parçalar (Explant'lar) kullanılır. Bunun için üretim ya pılacak anaç bitkilerden belirli parçalar alınır. Örneğin Rhododendrvnlaıda. toprak zemininin biraz üstünden alman 5-12.5 cm boyutlarındaki çeliklerin yaprak ve to murcuklan temizlendikten sonra daha önce belirtilen sterilizasyon tedbirlerine başvurulur. Sterilizasyon için pratikte fidanlıklarda en basit anlamda, çeliklerin de terjanla yıkanması veya % 70'lik alkolde veya kalsiyum hipoklorit de sterilize edil mesi veya evlerde kullanılan çamaşır suyunun % 10'luk solüsyonu kullanılır. Bu solüsyon çeliklerin üzerine 15 dakika süre ile damlatılarak ve bu arada suda çalka lanarak sterilizasyon kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Tabiatıyle eldivenle, kullanılan bütün laboratuvar malzemesinin sterilizasyonuna da azami itina gösterilmesi gere kir. Sterilizasyonun etkinliği ve içe nüfuz etmesi için çeliğin dip kısmında daha ön ce bir kertik açılması da faydalı olur. Sonra çelikler, içinde steril agar bulunan tüp lere yerleştirilir. Bu ortam içinde daha önce belirttiğimiz besleyici maddeler, büyü meyi tanzim eden hormonlar, özellikle herbir çeliğin yeterli miktarda tomurcuk ve dolayısıyle sürgün geliştirmesi için Cytokinin de bulunur. Tomurcuklar ve bunlar dan gelişen sürgüncükler (örneğin bir çelikten 100 adet kadar sürgün oluşabilmek- tedir) küçük seksiyonlara bölünerek (Resim: 208), tüplerde köklenme ve üre tim ortamlan içersine yer leştirilir. (Resim: 209, 203) steril şartlarda trans fer odasında çeliklerin bö lünmesini ve herbirinin içinde agarlı kültür ortamı bulunan tüplere yerleşti rilmesini göstermektedir. Bu ayırma işlemini yapar ken çalışma masasının üstüne bir köşeden devamlı steril hava püskürtülür.
Resim: 209. Transfer odasında steril şartlarda bitkiden alınan sürgün parçalarının bölünmesi ve içinde agar kültür ortamı bulunan tüplere yerleştirilmesi, Sağda üst köşede çalışanın yüzüne ve çalışma ma sasına doğru steril havayı püskürten bir püskürtücü görülmektedir.
Norris, C. Ann, 1984'den (Bkz. s. 440, dipnot *'den).
Sürgünler kesilip yeni agarlı kültür ortamına konduktan iki ay kadar sonra Rhododendron eksplantlerinde yani sürgün parçalarında kökler görülmeye başlar. Köklenme için düşük bir ışık düzeyi gerekir. Bunun için laboratuvarda büyüme odasında 100-300 foot-candle = 1100 - 3200. lux[8]'lük bir florasan ışığı gerekir.
Tüpler günde 16 saat bu ışık altında tutulur. Önemli olan diğer bir husus da odanın sıcaklığının 20-25°C (gündüz 25°C ve gece 20°C) olarak muhafaza edil mesidir (Resim: 210 a). Bu koşullarda fidanlar 6 ay ile 1 yıl içinde artık açık alana, kaplara alınacak duruma gelir. Bunun için önce tüpten alınan fidanlar, labora tuvar ile açık saha (fidanlık) arasında bir geçiş oluşturan seralarda kaplara alınır ve mist (şişleme) koşulları altında 2-3 ay bırakılır (Resim: 210 b, 202). Sonra fidanlar daha büyük kaplarda açık alana alınır ve orada 6 ile 8 ay kalırlar. Bu süre sonunda artık pazarlamaya veya daha büyük fidan elde etmek üzere repikaja ha zırdırlar.
Konunun girişinde de belirtildiği gibi Fransa'da in vitro teknikle Gül fidanları bu yöntemle çok ekonomik ve çok hızlı bir şekilde kitle halinde yetiştirilebilmekte- dir. Bilindiği gibi tradisyonal gül yetiştiriciliğinde önce fidanlık parsellerinde Yaba ni gül (Rosa canina) ekimi yapılmakta, bunlar 1 yıl sonra sökülerek repikaja alın makta, yaz ortasında anaç parsellerinden alınan aşı materyaliyle aşılanarak ancak konunun girişinde de belirttiğimiz gibi 4 yılda satışa hazır hale gelebilmektedir. Bu
na karşılık in vitro yöntemle aynı miktar ve aynı nitelikte gül fidan ları 10 ay içinde çok daha küçük bir sahada yetiştirilebilmektedir. Her iki yöntem mukayeseli ola rak (Resim: 211)'de gösterilmiş tir. In vitro yönteminde 2 gül anaç fidan 400.000 adet iyi nitelikli gül üretimine yettiği ve bunun için 1 hektarlık saha gerektiği halde kla sik yöntemde 1,5 hektar anaçlık yabani gül fidanı parseli ile 10,5 hektar repikaj alanına ihtiyaç ol duğu bildirilmektedir. Ayrıca tra- disyonel yöntemde tek tek aşıla manın gerektirdiği iş gücü de dik kate alındığında ve üretimin de 4 yılda gerçekleştirildiği düşünü lürse, bu aynı boyutta 1 yılda elde edilen gül fidanları fidanlık işlet mesine ne büyük bir avantaj sağ ladığı kolaylıkla anlaşılır.
İğne yapraklı türlerde de bugün mikro üretimde başarılı sonuçlar alınmakta dır. Örneğin Fransa'da Sahilçamlan (Pinus pinastery&t yapılan bir üretim çalış masında alınan sonuçlar da bunu kanıtlamaktadır[9].
John, L. ve arkadaşları doku kültüründe en zor safhanın fıdeciklerin doğal yetişme ortamına yani toprağa intikal ettiği devre olduğunu bildirmektedirler[10].
Chee, R. de işin zor safhasının test tüplerinde geliştirilen fıdeciklerin sera ya intikali olduğunu teyid etmektedir[11]. (Resim: 210 b) tüplerde geliştirilen doku kültürlerinin seralara intikal ettirilmek üzere kaplara plante edilmelerini göster mektedir. Bu safhada toprak karışımı, su, nisbi rutubet, ışık ve yetiştirildiği kap nitelikleri fıdeciğin canlı kalmasında etkili olur. Ayrıca toprak sterilize edilmiş olmalı ve toprağa perlit veya vermülit, kabuk, kum ve turba karıştırılmalıdır. Bu ka rışım yeterli bir havalanma kabiliyetine sahip olduğu gibi rutubeti de tutar. Kap lar da yeni veya sterilize edilmiş kaplar olmalıdır (Resim: 207). Fideciklerin hayatiyetinde kapların temizliği yanında uygun boyutlarda olması da etkin rol oy nar. Doku kültürlerinin laboratuvar dışında yetiştirilmesinde ışık ayarlaması da önemlidir. Bunun için bez, kamış, çıta v.s. ile tesis edilen % 90 gölge koşullarında, fıdecikler 4 hafta kaldıktan sonra % 73-80 oranında gölgelendirilmiş seralara alınır ve ışık entansitesi gittikçe yükseltilerek zamanla normal ışık koşullarına ulaştırılır.
FİDANLIK VE YETİ?TİRME TEKNİĞİ
Prof Dr. Suat Ürgenç
2.1.3.2.1. Kültüre Alınacak Türlerin Seçimi
Bazı kolay köklenen türlerde bu yöntem gerekli olmaz. Örneğin Kolyos, Da imi yeşil yapraklı Azelea'lar kolay köklendikleri için bu yöntemi uygulamaya lü zum yoktur. Buna karşılık ekseri koniferlerde bu yöntem henüz ticari olarak başarılı sayılmaz. Bununla beraber otsu bitkiler yanında ekseri odunsu bitkilerde de yöntem gittikçe yaygınlaşmaktadır.
Bu yöntemle hali hazır koşullarda üretilmesi başarı vadeden cinsler şöyle ve rilebilir:
Eğreltilerden Nephrolepsis, Platycerium, Pinacea'lardan Pinus (P. palustris), Sequioia spp., Araceae'lerden Anthurium spp., Syngonium spp., Lillaceae'lerden Asparagus spp., Lillum spp. Amaryûlidaceae lerden Amaryllis spp., Hypoxis spp., Iridaceae'lerden iris spp., Orchidaceae\&vdc\\ Cattleya spp, Cymbidium spp., Crassulaceae' lerden Kalanchoe spp., Rosaceae'lerden Amelanchier spp., Malus spp., Prunus spp., Rosa spp., Vıtaceae'lerden Vitis spp., Begoniaceae'\er- den Eucalyptus spp., Ericaceae'lerden Rhododendron spp., Vaccinium spp., Pri- mulaceae'\erden Primula spp., Gesneriaceae lerden Saintpaulia spp., Composi- tae' lerden Gerbera spp., Chrysanthemum spp.
Hernekadar bazı konifer türleri bu listede yer almakla beraber genelinde ko- niferler uygulamada henüz ticari anlamda başarılı sayılacak durumda değildir.
Yukarıda başarılı türler olarak yer alan türler arasında özellikle Rhododendron kültürlerinde bu yöntem bugün çok genişletilmiştir. Briggs Nursery (U.S.A.) 200 kadar Rhododendron varyetesi üzerinde bu yöntemi programa almış ve kitle üreti mine başlamıştır (Resim: 202). Ayrıca aynı fidanlık Defne (Laurus montana), Ayı üzümü (Vaccinium corymbosum), Açelya spp., Süpürge çalısı (Calluna vulgaris), Coreopsis spp., Huş spp., Amelanchier spp., Prunus spp., Elma spp., Kiraz spp., Gül spp., Ispirye spp., Clematis spp., Fransız hibrit leylakları, Böğürtlenler, Liîhos- permum spp., Hypericum 'larda da doku kültürü yöntemleri uygulamaktadır.
Bu yöntemle üretilecek bitkiler için, ticari fidanlıklarda seçilecek türlerin ay nı zamanda pazar potansiyeli bulunması, üretim maliyetinin satışlarla karşılana bilir olması, sağlık durumlarının kolay bir şekilde kontrol altına alınabilmesi ve nihayet sözkonusu türün tradisyonel üretiminin güç olması koşulları aranır ve an cak bu durumlarda bu yönteme başvurulur.
2.1.3.2.2. Çalışmanın Gerektirdiği Tesis ve Ekipmanlar
Laboratuvar tesislerinin büyüklüğü önemli değildir. Bu, çalışma kapasitesine göre ayarlanır.
Kurulması gereken tesisler üç gruba ayrılmaktadır. (Resim: 205) küçük bir kültür laboratuvarının planını içermektedir. Orta ve daha büyük kültür laboratu- varlan daha komplike bir düzen içinde kurulmaktadır (Bu konuda geniş bilgi Bkz. Kyte Lydianee)[6].
Laboratuvar tesisleri:
1. Ortam hazırlama odası.
2. Transfer odası.
3. Kültür büyütme odası
olmak üzere 3 ana üniteden oluşmaktadır.
Zorunlu durumlarda yahut geçici olarak bu üç hizmet aynı odada da biraraya getirilmektedir. Fakat uzun süreli çalışmalarda ve seri üretim yapılması ön görülmesi durumunda bu koşullar için, bu işlem yerlerinin daha sonra birbirinden ayrılması gerekir.
"Ortam hazırlama odası" bir mutfağa benzer. Sıcak ve soğuk suyu olan, bir lavabo, buzdolabı ve bulaşık makinesi gerekir. Bu odada daha sonra belirtilecek çok çeşitli besin tuzları, sakaros, bazı hormon, aminoasit ve agar gibi besleyici, köklendirici kimyasal maddeler, likit veya solüsyon halinde çeşitli ortamlar hazır lamak üzere bulundurulur. Hazırlanan ortamları ısıtma, karıştırma, dağıtma, ste rilize etme ve depolama işlemleri bu bölümde gerçekleştirilir.
"Transfer odası" kültür için steril bir ortam oluşturur. Bu ortama hava, yük
sek etkili partiküler hava filtrelerinden geçerek gi rer. Amatörce küçük ça lışmalar için bu işi, küçük ve basit bir kutu veya kap içinde yapmak da müm kündür (Resim: 206-3). Teknisyen onun içinde materyali böler ve diğer kaplara transfere hazır ha le getirir (Resim: 206-1, 2). Transfer odasında ay rıca depolama yerleri, otoklav, lavabo da uygun yerlere yerleştirilmiş ola rak bulunmalıdır.
"Kültür büyütme odası" ise sıcak, iyi ışık landırılmış raflara sahip bir odadır. Raflar tel ka fesler halindedir. Bu su retle hava sirkilasyonuna da en iyi şekilde imkan verirler. Rafların üzerine istenen ışık entansitesine göre belli bir yükseklikte yerleştirilen ve beyaz ışık veren Horasanlar konur. Bunlar belli bir zaman saatine bağlı olarak çalıştırılır. Yeni tekniklerde bu florasanlann yüksek sıcaklıklar oluş turması da engellenmektedir. Bu raflara kültür kaplan olarak kavanozlar veya tüp ler içindeki de büyümeye bırakılan bitkisel materyal parçalan (eksplantler) yer leştirilir. Kültür büyütme odasında dışa açılan pencereler olmamalıdır. Aksi halde yetişme ortamı koşullarının düzenlenmesi esnasında dıştan gelen ve zaman za man değişen ışık ve güneşin sıcaklık etkileri kontrol altına alınamaz ve stabil bir ortam yaratılamaz. Ayrıca elektrik donatımında daha önce belirttiğiniz gibi lam- balann yüksek sıcaklık vermeleri önlenmelidir. Zira kültür büyüme odasında 24- 29°C sıcaklık uygundur ve bu derece sıcaklıklar sıcak hava verilerek kontrol al tında tutulmalı ve sistem elektrostatik bir hava fılitresiyle donatılmalıdır. Kültür büyütme odasında günün 16 saatinde aydınlatma yapılarak bu otomatik olarak kontrol altına alınmalıdır.
Doku kültürü programının başarılı olması için her şeyden evvel yakın çevre nin de temiz bir yer olması istenir. Bunun için çevrenin beton ve asfalt kaplı, toz ve kimyevi kirlenmenin olmadığı bir yer olması gerekir. Bir bina, ofis veya sera nın bir kısmı bu işe ayrılabilir. Ancak bitişik odalarda bir bulaşma olasılığı bulun mamalıdır ve aynı zamanda kolay temizlenebilir bir yer olmalıdır. Başlangıçta amatör çalışmalar için bir mutfağa hava ceryanından etkilenmeyen bir yere bir kutu yerleştirip içi ışıklandırılmış raflarla donatılarak bir çalışma ortamı oluşturu labileceği belirtilmektedir. Ancak her şeyden evvel çeşitli kimyevi maddeler ve türlere göre birbirinden farklı ortamların hazırlanması konusunda bilgi sahibi olunması ve laboratuvar tekniğinin bilinmesi gerekir.
Ortam hazırlama, transfer ve kültür büyütme odalarının birbiriyle irtibatları ve ilişkileri (geçişler, kapılar, transfer) pencereler iyi ayarlanmalıdır. Transfer ve kültür büyütme odalarının özellikle dış kapılardan ve insanların çokça gelip geç tiği yerlerden iyi izole edilmesi lâzımdır. Laboratuvar, otopark, trafik yollan ve bunların toz, ekzos v.s. tesirlerinden en az etkilenecek şekilde yerleştirilmeli, et- raflannda çim sahalan ve hastalıklardan ari çalılarla temiz ve havadar bir mekan oluşturulmalıdır. Bina ve laboratuvarın temizliği bu yöntemin uygulanmasında esastır. Bakteri ve sporların kültüre havadan veya kap ve ekipmanlardan kolaylık la bulaşması mümkündür. Bu etkinin bir sterilizasyonla önlenmesi gerekir. Zira doku kültürü ortamlan bakteri ve sporlann gelişmesi için çok müsaittir. Bunlar kolaylıkla yeni bitkiye veya kültüre geçerek etkili olurlar. Ziyaretçilerin buralar da ayakkabılarıyla dolaşmalan dahi büyük sakınca yaratır. Ziyaretçiler ayakkabı larının üzerine plastik torbalar geçirerek içeri girmelidirler. Döşemeleri çok sık li- sollü su ile yıkamalıdır. Toz kaldırması muhtemel vakumlu alet ve süpürgeler bu tesislerde kullanılmamalı, yerler ve masalar lisol solüsyonlu süngerlerle her gün temizlenmelidir. Hiç olmazsa duvarlar ve ekipmanlar haftada bir kere dezenfek ten bir solüsyonla yıkanmalıdır. Transfer odasında ön kapak fılitresi 4 ayda bir de ğiştirilmeli, personel laboratuvar önlükleri ve saçları daima temiz tutulmalıdır.
Gerekli ekipmanlara gelince:
Başanlı bir çalışma için su ve onun kalitesi, özellikle kültür ortamları için çok önemlidir. Musluk suyu genellikle bazı erimemiş mineraller içerir. Bunlar kullanımdan evvel uzaklaştınlmalıdır. Aksi halde ortamda beslenme dengesini bozarlar. Su saflığı da zaman zaman ölçülmelidir. Su destilasyonunda uygun yön temler ve kombinasyonlan bilinçli olarak seçilmelidir.
Kimyevi maddeler ve ortam hazırlamada 2-4 mgr'lık hassas analitik teraziler bulundurulmalıdır.
445
Ortamların asiditeleri oldukça değişik olarak hazırlanmaktadır. Örneğin Rhododendron kültürleri için doku kültürü üretme ortamları 4.5-5.0 pH, Çileğin- kinin 5.7 pH olması istenir. Bu durumda pH ölçmeleri önemlidir ve dolay isiyle özellikle 2-9-8.0 pH arası değerleri hassasiyetle ölçebilen pH ölçerlere ihtiyaç vardır.
Kaplarda hazırlanan çeşitli ortamların ısıtılması ve karıştırılması için de çe şitli gaz ısıtıcıları ve mikserler, çalka makineleri gereklidir. Hazırlanan ortamı pi petlerle tüplere dağıtmada mekanik yöntem yerine otomatik dağıtıcılar kullanıla rak iş 5 misli daha süratlendirilebil- mektedir.
Tüp ve kavanozların sterilize edi ci otoklav ve benzeri ekipmanlardan geçirilmesi gerekir (Resim: 207).
Hazırlanan likit ortamını çalkala yarak yeterli bir kıvama getirebilecek santrfüj (rototar)lar ve bulaşık yıkama makineleri ile kimyevi madde ve or tam solüsyonlarını depolamak için (ki bunlar l-3°C'de saklanır) buzdolapla- rına gereksinim vardır.
Ayrıca doku kültürü yapılacak türlere bağlı olarak da bu çalışmaya uygun nitelikli bir mikroskopa da ihti yaç olacaktır. Meristem faaliyetinin başlamasını takip için bir tanımlama mikros- kopu da gereklidir. Rutin ve ticari işler için komplike bir mikroskopa gereksinim yoktur. Hatta alınan parçalar mikroskopik olmadığı zaman üretimde mikroskopa da gereksinim olmaz.
Ayrıca detaylı bir malzeme ihtiyaç listesinin 50'yi aşkın çeşitli malzeme ile hazırlanması da gerekmektedir (Bkz. Kyte s. 31-33)
Resim: 207. Tüp ve kavanozlar sterilize edici otoklavlardan geçirilir. Kyte, L. Plants from Test Tubes'den.
Kültür Ortamının Hazırlanması
însan ve hayvanlardaki somatik hücrelerin ve dokuların aksine bazı bitkisel hücreler (meristem hücreler) çoğalarak kök, gövde ve tepeye sahip yeni bir bitki yi oluşturabilme niteliğine sahiptir demiştik. Bu yeteneğe (totipotans olayına) da yanarak bazı bitki hücrelerinden in vitro ortamlarda fidan üretilebilmektedir. Bu
kültür ortamlarında "eksplant" denilen bitki parçaları bütün bir fidanı oluştura bilmektedir. Bu kültür ortamlarının hazırlanmasında inorganik ve organik çeşitli kimyasal maddeler kullanılmaktadır.
Kullanılan kimyasal maddeler:
Doku kültürünün gelişme yapacağı ortam büyük önem taşır. Ayrıca laboratu var çalışmaları ve kimya alanında yeterli bir birikime sahip olmak da gerekir.
Yetiştirme ve geliştirme ortamları çok çeşitli kimyasal maddelerden oluştu rulur.
Makro elementler olarak azot, fosfor, potasyum, sülfür, kalsiyum, maynez- yum ve demir gerekir. Bu makro elementler bitki beslenmesinde yapısal element lerdir. Bunlardan fosfor enerji metabolizmasında önemli rol oynar, magnezyum klorofil monoküllerinin oluşturulmasında, demir solunum ve fotosentezde, oksi- dasyon ve rediksiyonda etkilidirler. Kalsiyum ve magnezyum enzim sistemlerin de fizyolojik rol oynarlar.
Minör elementler olarak B (Bor), Mn (Mangenez), Co (Kobalt), Zn (Çinko), Cu (Bakır), C1 (Klor) sözkonusudur: bu minör elementler katalitik bir etkiye sa hiptirler.
Kullanılan ortamların pH'ları genellikle 4.5-5.7 pH arasında ayarlanır. Ortam çok asit ise NaOH ilavesiyle asidite azaltılabilir. Ortamın pH'ı yüksek ise Hcl ila vesiyle reaksiyon düşürülebilir.
Organik kimyevi maddeler olarak da; Sakaroz, tnesital, Thitiamin (B, vita mini içerikli), Nikotinik asit, çeşitli B vitaminleri ve kültürlerin enfeksiyonlara karşı korunması için bazı antibiyotikler de ortama katılmaktadır.
Ayrıca Auxinler, Cytokinin, Adenin, Gibberilin gibi çeşitli organik menşeli kimyasal maddelerin de türlere göre değişik oranlarda kullanımı gerekmektedir.
Esas itibariyle auxinleri içeren hormonlar kök durumunu teşvik ederken Cytokinin içerenler toprak üstü kısımlarının gelişimini hızlandırırlar.
Böylece doku kültürü için hazırlanan ortama çeşitli besin tuzlan, sakaroz, ba zı hormon, aminoasit ve hatta antibiyotikler dahil olmaktadır.
Oluşturulan gelişme ortamlannda Auxinler ve bazan da fenolamidler köklen- dirmede, gibberilin gövdeyi uzatmada ve gene gibberilin ve cytokinin tomurcuk ların çoğalmasında ve sürgünlerin büyümesinde etkin olurlar. Ortama giren bu maddeler ve yeni yeni araştırmalar zenginleştirilmekte, yenileri de ortaya çıkmak tadır. Bunlardan en son fenol amitler'in kullanımı 1970 yıllarında belirlenmiştir.
Çalışmalar zamanımızda daha da yoğunlaştırılmaktadır.
Ancak işin en çetin tarafı, üzerinde çalışılacak türe uygun ortamın araştırılıp, bulunup kullanılmasıdır.
Bu konuda çeşitli formüller kullanılmakta ve önerilmektedir. Bunlardan en süratli ve en yüksek sonucu verenler uygulamaya intikal ettirilmektedir. Bu çok çeşitli formüller son yıllarda bazı yayınlarda geniş ölçüde ele alınmaktadır.
Bunlar içinde süratli, kolay ve basit bir formül burada verilmekle yetinilecektir.
Bu formül şu maddeleri içermektedir:
1/8 kap (ölçek) kullandığımız şeker
1 kap musluk suyu
1/2 kap 10: 10: 10 oranlı NPK kimyevi karışık gübreden. 1 galon (3,8 İt) erimiş halde ha zırlanan eriyik
1/2 tablet Inositol (250 mg'lik) 1/4 tablet thiaminli vitamin tablet
2 çorba kaşığı agar
Eriyik agar yumuşayana kadar kaynatılmakta, karıştırılmakta ve büyütme ka vanozu veya tüpüne 1,25 - 2,5 cm kalınlıkta olacak şekilde konmakta, üzeri bir mantar veya kapakla kapatılmaktadır. Bundan sonra eriyik 15 pound basınç altın da 15 dakika kadar fırına konmaktadır. Bu arada kullanılan karıştırıcı ve pinset gi bi aletler de sterilize edilmelidir.
Hazırlanan depo solüsyonlar da buzdolabında depo edilir. Bu depo edilen solüsyonlar:
Majör ve minör tuzlar solüsyon halide
Vitaminler
Demir solüsyonu
Bengyladine solüsyonu
Indol 3 butric asit (IBA) solüsyonu
Gibberellic asit solüsyonu
olmak üzere herbiri kendi içinde belli nisbetlere göre hazırlanır. Örneğin majör ve minör tuzlara girecek birçok kimyasal madde belli oranlarda biraraya getirilerek bu tuz solüsyonu oluşturulur. Sonra bu depo solüsyonları türlere göre değişik oranlarda olmak üzere biraraya getirilerek ve hazırlanmış agarlı ortama ilave edi lerek büyüme ortamı hazırlanmış olur.
Bu ortam hazırlama işleri, belli bir türle çalışıp yeterli bir alışma süresi geçi rilmiş yerlerde nispeten kolay olmakla beraber bu işlemler oldukça uğraştırıcı ve laboratuvar deneyimini gerektirici işlerdir. Ancak son zamanlarda bazı hazır ortamların ortaya çıkmaya başlamış olması bu konudaki uygulamaların oldukça pratikleştirmesi ve yaygınlaşmasına yol açması beklenir
2.1.3.2.3. Mikro Üretim
Bir bitki türünün bu yöntemle çabuk üretilmesi istendiği zaman genellikle to murcuklardan alınan küçük parçalar (Explant'lar) kullanılır. Bunun için üretim ya pılacak anaç bitkilerden belirli parçalar alınır. Örneğin Rhododendrvnlaıda. toprak zemininin biraz üstünden alman 5-12.5 cm boyutlarındaki çeliklerin yaprak ve to murcuklan temizlendikten sonra daha önce belirtilen sterilizasyon tedbirlerine başvurulur. Sterilizasyon için pratikte fidanlıklarda en basit anlamda, çeliklerin de terjanla yıkanması veya % 70'lik alkolde veya kalsiyum hipoklorit de sterilize edil mesi veya evlerde kullanılan çamaşır suyunun % 10'luk solüsyonu kullanılır. Bu solüsyon çeliklerin üzerine 15 dakika süre ile damlatılarak ve bu arada suda çalka lanarak sterilizasyon kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Tabiatıyle eldivenle, kullanılan bütün laboratuvar malzemesinin sterilizasyonuna da azami itina gösterilmesi gere kir. Sterilizasyonun etkinliği ve içe nüfuz etmesi için çeliğin dip kısmında daha ön ce bir kertik açılması da faydalı olur. Sonra çelikler, içinde steril agar bulunan tüp lere yerleştirilir. Bu ortam içinde daha önce belirttiğimiz besleyici maddeler, büyü meyi tanzim eden hormonlar, özellikle herbir çeliğin yeterli miktarda tomurcuk ve dolayısıyle sürgün geliştirmesi için Cytokinin de bulunur. Tomurcuklar ve bunlar dan gelişen sürgüncükler (örneğin bir çelikten 100 adet kadar sürgün oluşabilmek- tedir) küçük seksiyonlara bölünerek (Resim: 208), tüplerde köklenme ve üre tim ortamlan içersine yer leştirilir. (Resim: 209, 203) steril şartlarda trans fer odasında çeliklerin bö lünmesini ve herbirinin içinde agarlı kültür ortamı bulunan tüplere yerleşti rilmesini göstermektedir. Bu ayırma işlemini yapar ken çalışma masasının üstüne bir köşeden devamlı steril hava püskürtülür.
Resim: 209. Transfer odasında steril şartlarda bitkiden alınan sürgün parçalarının bölünmesi ve içinde agar kültür ortamı bulunan tüplere yerleştirilmesi, Sağda üst köşede çalışanın yüzüne ve çalışma ma sasına doğru steril havayı püskürten bir püskürtücü görülmektedir.
Norris, C. Ann, 1984'den (Bkz. s. 440, dipnot *'den).
Sürgünler kesilip yeni agarlı kültür ortamına konduktan iki ay kadar sonra Rhododendron eksplantlerinde yani sürgün parçalarında kökler görülmeye başlar. Köklenme için düşük bir ışık düzeyi gerekir. Bunun için laboratuvarda büyüme odasında 100-300 foot-candle = 1100 - 3200. lux[8]'lük bir florasan ışığı gerekir.
Tüpler günde 16 saat bu ışık altında tutulur. Önemli olan diğer bir husus da odanın sıcaklığının 20-25°C (gündüz 25°C ve gece 20°C) olarak muhafaza edil mesidir (Resim: 210 a). Bu koşullarda fidanlar 6 ay ile 1 yıl içinde artık açık alana, kaplara alınacak duruma gelir. Bunun için önce tüpten alınan fidanlar, labora tuvar ile açık saha (fidanlık) arasında bir geçiş oluşturan seralarda kaplara alınır ve mist (şişleme) koşulları altında 2-3 ay bırakılır (Resim: 210 b, 202). Sonra fidanlar daha büyük kaplarda açık alana alınır ve orada 6 ile 8 ay kalırlar. Bu süre sonunda artık pazarlamaya veya daha büyük fidan elde etmek üzere repikaja ha zırdırlar.
Konunun girişinde de belirtildiği gibi Fransa'da in vitro teknikle Gül fidanları bu yöntemle çok ekonomik ve çok hızlı bir şekilde kitle halinde yetiştirilebilmekte- dir. Bilindiği gibi tradisyonal gül yetiştiriciliğinde önce fidanlık parsellerinde Yaba ni gül (Rosa canina) ekimi yapılmakta, bunlar 1 yıl sonra sökülerek repikaja alın makta, yaz ortasında anaç parsellerinden alınan aşı materyaliyle aşılanarak ancak konunun girişinde de belirttiğimiz gibi 4 yılda satışa hazır hale gelebilmektedir. Bu
na karşılık in vitro yöntemle aynı miktar ve aynı nitelikte gül fidan ları 10 ay içinde çok daha küçük bir sahada yetiştirilebilmektedir. Her iki yöntem mukayeseli ola rak (Resim: 211)'de gösterilmiş tir. In vitro yönteminde 2 gül anaç fidan 400.000 adet iyi nitelikli gül üretimine yettiği ve bunun için 1 hektarlık saha gerektiği halde kla sik yöntemde 1,5 hektar anaçlık yabani gül fidanı parseli ile 10,5 hektar repikaj alanına ihtiyaç ol duğu bildirilmektedir. Ayrıca tra- disyonel yöntemde tek tek aşıla manın gerektirdiği iş gücü de dik kate alındığında ve üretimin de 4 yılda gerçekleştirildiği düşünü lürse, bu aynı boyutta 1 yılda elde edilen gül fidanları fidanlık işlet mesine ne büyük bir avantaj sağ ladığı kolaylıkla anlaşılır.
İğne yapraklı türlerde de bugün mikro üretimde başarılı sonuçlar alınmakta dır. Örneğin Fransa'da Sahilçamlan (Pinus pinastery&t yapılan bir üretim çalış masında alınan sonuçlar da bunu kanıtlamaktadır[9].
John, L. ve arkadaşları doku kültüründe en zor safhanın fıdeciklerin doğal yetişme ortamına yani toprağa intikal ettiği devre olduğunu bildirmektedirler[10].
Chee, R. de işin zor safhasının test tüplerinde geliştirilen fıdeciklerin sera ya intikali olduğunu teyid etmektedir[11]. (Resim: 210 b) tüplerde geliştirilen doku kültürlerinin seralara intikal ettirilmek üzere kaplara plante edilmelerini göster mektedir. Bu safhada toprak karışımı, su, nisbi rutubet, ışık ve yetiştirildiği kap nitelikleri fıdeciğin canlı kalmasında etkili olur. Ayrıca toprak sterilize edilmiş olmalı ve toprağa perlit veya vermülit, kabuk, kum ve turba karıştırılmalıdır. Bu ka rışım yeterli bir havalanma kabiliyetine sahip olduğu gibi rutubeti de tutar. Kap lar da yeni veya sterilize edilmiş kaplar olmalıdır (Resim: 207). Fideciklerin hayatiyetinde kapların temizliği yanında uygun boyutlarda olması da etkin rol oy nar. Doku kültürlerinin laboratuvar dışında yetiştirilmesinde ışık ayarlaması da önemlidir. Bunun için bez, kamış, çıta v.s. ile tesis edilen % 90 gölge koşullarında, fıdecikler 4 hafta kaldıktan sonra % 73-80 oranında gölgelendirilmiş seralara alınır ve ışık entansitesi gittikçe yükseltilerek zamanla normal ışık koşullarına ulaştırılır.
FİDANLIK VE YETİ?TİRME TEKNİĞİ
Prof Dr. Suat Ürgenç