Tweet
PCR Tekniği Kullanılarak Tanımlanması
Mücahit Taha Özkaya, Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Ankara Erkan Ergülen, Düzen Laboratuarları, Ankara Salih Ülger, Akdeniz Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Antalya Nejat Özilbey, Zeytincilik Araştırma Enstitüsü, Bornova, İzmir.
ÖZET:
Anadolu'da yetiştiriciliği yapılan bir çok zeytin (Olea europaea L.) çeşidi bulunduğu halde bunların morfolojik ve biyolojik özellikleri henüz tam olarak belirlenmiş değildir. Bunlardan çok az bir kısmının özellikleri belirlenmiş olduğu halde, bunların da içlerinde genotipik veya fenotipik nedenlere bağlı varyasyonların olduğu gözlenmektedir. RAPD-PCR tekniği ile genetik farklılıkların belirlenmesi üzerine yapılan bu çalışmada İzmir-Bornova Zeytincilik Araştırma Enstitüsü, Kolleksiyon Bahçesinden elde edilen 10 zeytin çeşidi (Ayvalık, Derik Halhali, Domat, Gemlik, Kilis Yağlık, Manzanilla, Memecik, Nizip Yağlık, Sarı Ulak ve Tavşan Yüreği) kullanılmıştır. Diğer yandan elde edilen verileri destekleyebilmek amacıyla pomolojik ve biyokimyasal gözlem ve analizler de yapılmıştır. Mevcut çeşitler arasında, Derik Halhali genetik ve biyokimyasal olarak en farklı sonuçlar gösteren çeşit olmuştur.
GİRİŞ:
Zeytinin (Olea europaea L.) anavatanı, Güney Doğu Anadolu bölgesini de içine alan Yukarı Mezopotamya olduğu halde, ülkemizde hem tarım teknikleri hem de sanayi olarak zeytincilik gelişmiş değildir. Bunun değişik nedenleri arasında mevcut çeşitlerden kaynaklanan sorunlar da vardır. Bu sorunların başında çeşit ve tiplerin morfolojik ve biyolojik özelliklerinin tam bilinmemesi gelmektedir. Morfolojik ve biyolojik tanımlaması yapılmış olan bir çeşidin içinde ise, meydana gelen varyasyonun genotipik veya fenotipik olup olmadığı bilinmemektedir. Üreticiler fenotipik olabilecek yararlı bir özeliğin kendi çeşitlerinde olmaması nedeniyle ağaçlarını yeniden aşılama yoluna gitmektedirler. Aşılamada kullanılacak çeşitlerin veya alınacak fidanların, arzu edilen zeytin çeşidi ile aynı olup olmadığının ağacın yetişme evresine bağlı olmayan bir yöntemle genetik olarak belirlenmesi üreticileri rahatlatabilecektir. Zeytin yetiştiriciliği ile ilgili bu sorunların çözülmesinde atılacak adımları belirlemek genetik tanımlama işlemlerinin kullanım alanlarından örnekler vermek üzere yapılan bu çalışmada. Zeytincilik Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü (Bornova, İzmir), bahçesinde bulunan morfolojik tanımlaması yapılmış olan bazı standart çeşitlerimizin RAPD-PCR yöntemi ile genetik polimorfizmi belirlenmiş, morfolojik tanımlamalarına yer verilmiş ve aynı zamanda meyvenin biyoloj ik (yağ asitleri kompozisyonu) özellikleri tanımlanmıştır.
MATERYAL ve METOD: RAPD-PCR analizleri: Çalışma, zeytin yapraklarından elde edilen DNA ve dekamer oligonükleotidler kullanılarak, DNA çoğaltma işlemi esasına dayanan RAPD-PCR yöntemi ile yapılmıştır. DNA ekstraksiyonu: Toplam DNA ekstraksiyonu taze zeytin yapraklarından, biraz değiştirilen CTAB metodu (Doyle ve Doyle, 1987) uygulanarak yapılmıştır. Gaz kromatografisi yöntemi ile zeytinyağında
yağ asidi dağılımı: Çalışmada, zeytin tanelerinin ezilmesi sureti ile çıkarılan yağ, esterleştirilerek Yağ asidi metilester haline getirilmiş ve Gaz kromatografisi yöntemi ile analiz edilmiştir (Boas ve ark., 1994).
SONUÇ ve ÖNERİLER: RAPD-PCR yöntemi ve kullanılan Operon primerleri ile zeytin yapraklarından izole edilen DNA numunelerinden, farklı boyutlardaki DNA fragmentlerini çoğaltmak mümkün olmuştur. Bu çalışmada, tekrarlanabilir fragment sayısı 1 ile 5 arasında değişmektedir. Bazı numunelere ait RAPD-PCR çalışmalarının çelişkili sonuçlar verebildiği ve tekrarlanması gerektiği gözlenmiştir. İzole edilen DNA numunelerinin kalitesinin zamanla düştüğü ve çelişkili sonuçların kaynağı olabildiği dikkat çekmiştir. Bu nedenle çalışmalar yeni izole edilmiş DNA ile yapılmalı ve aynı zamanda ve aynı deney koşullarında yapılan çalışmalara ait veriler değerlendirmeye alınmalıdır. Deneylerde kullanılan çeşitli kombinasyonlardaki primer setlerinin seçimi genetik yakınlık tablolarını etkilemektedir. Farklı primer setleri ile elde edilen verilerin kullanılması analiz edilen zeytin çeşitlerinin dendrogramdaki yerlerini değiştirebilmektedir. RAPD-PCR çalışmaları bu teknik sınırlamalar dikkate alınarak yürütülmeli ve değerlendirilmelidir. Bu çalışma, mevcut zeytin çeşitlerini az sayıda primer kullanarak karşılaştıracak, dolayısı ile farklılıklarını gösterebilecek şekilde düzenlenmiştir. Popülasyon genetiği çalışması adı verilebilecek bir çalışma daha fazla primer (lokus) ve AFLP gibi ilave moleküler teknikler kullanılarak yapılmalıdır. Zeytin bitkisinin olukça polimorfik olduğu belirtilmektedir. Seçilen bir kaç primer ile türler arasındaki farklılığı göstermek mümkün olmuştur. Bu farklılık koleksiyon bahçesinden alman standart zeytin çeşitlerinde daha belirgindir. Bu çalışmada zeytinlerin yetiştiği coğrafi bölgeler ile yakınlık dereceleri arasında bir ilişki tespit edilememiştir. Bu durum başka araştırıcılar tarafından da gösterilmiştir (Fabbri ve ark., 1995). Bu farklılıklar kesin olarak bir özellik ile ilişküendirilemese de RAPD-PCR yöntemi, zeytin aşılanmasında, farklı türlerin oluşturulmasında yapılan işlemin zeytin DNA'sma yaptığı değişikliklerin bir göstergesi, bir takip metodu olarak kullanılabilir. Farklı zeytin tiplerinin karakterizasyonu için morfolojik özellikler önemli faktörlerdir. İklim ve çevre koşulları göz önüne alındığında morfolojik özelliklerin buna göre değişebileceği düşünülmelidir. Bu nedenle biyometrik çalışmaların sağlıklı sonuç verebilmesi için uzun zamana ihtiyaç vardır. Sonuçları İklim ve çevre koşullarından etkilenmeyen RAPD-PCR yöntemi burada hızlı bir alternatif sunmaktadır.
Sonuç olarak bu çalışma yerine daha kesin sonuç veren yeni yöntemler kullanılarak milli koleksiyonumuzdaki zeytin tip ve çeşitlerinin özelliklerinin çıkartılması gerekmektedir. Bu amaçla yürütülmekte olan veya yeni sunulan çalışmaların bir an evvel tamamlanması gerekmektedir. Şu hali ile bu çalışma ile elde edilen genetik verilerden çok biyolojik ve yağ asitleri yönünden farklılıklara bakarak sonuca varılabilir.
Mücahit Taha Özkaya, Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Ankara Erkan Ergülen, Düzen Laboratuarları, Ankara Salih Ülger, Akdeniz Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Antalya Nejat Özilbey, Zeytincilik Araştırma Enstitüsü, Bornova, İzmir.
ÖZET:
Anadolu'da yetiştiriciliği yapılan bir çok zeytin (Olea europaea L.) çeşidi bulunduğu halde bunların morfolojik ve biyolojik özellikleri henüz tam olarak belirlenmiş değildir. Bunlardan çok az bir kısmının özellikleri belirlenmiş olduğu halde, bunların da içlerinde genotipik veya fenotipik nedenlere bağlı varyasyonların olduğu gözlenmektedir. RAPD-PCR tekniği ile genetik farklılıkların belirlenmesi üzerine yapılan bu çalışmada İzmir-Bornova Zeytincilik Araştırma Enstitüsü, Kolleksiyon Bahçesinden elde edilen 10 zeytin çeşidi (Ayvalık, Derik Halhali, Domat, Gemlik, Kilis Yağlık, Manzanilla, Memecik, Nizip Yağlık, Sarı Ulak ve Tavşan Yüreği) kullanılmıştır. Diğer yandan elde edilen verileri destekleyebilmek amacıyla pomolojik ve biyokimyasal gözlem ve analizler de yapılmıştır. Mevcut çeşitler arasında, Derik Halhali genetik ve biyokimyasal olarak en farklı sonuçlar gösteren çeşit olmuştur.
GİRİŞ:
Zeytinin (Olea europaea L.) anavatanı, Güney Doğu Anadolu bölgesini de içine alan Yukarı Mezopotamya olduğu halde, ülkemizde hem tarım teknikleri hem de sanayi olarak zeytincilik gelişmiş değildir. Bunun değişik nedenleri arasında mevcut çeşitlerden kaynaklanan sorunlar da vardır. Bu sorunların başında çeşit ve tiplerin morfolojik ve biyolojik özelliklerinin tam bilinmemesi gelmektedir. Morfolojik ve biyolojik tanımlaması yapılmış olan bir çeşidin içinde ise, meydana gelen varyasyonun genotipik veya fenotipik olup olmadığı bilinmemektedir. Üreticiler fenotipik olabilecek yararlı bir özeliğin kendi çeşitlerinde olmaması nedeniyle ağaçlarını yeniden aşılama yoluna gitmektedirler. Aşılamada kullanılacak çeşitlerin veya alınacak fidanların, arzu edilen zeytin çeşidi ile aynı olup olmadığının ağacın yetişme evresine bağlı olmayan bir yöntemle genetik olarak belirlenmesi üreticileri rahatlatabilecektir. Zeytin yetiştiriciliği ile ilgili bu sorunların çözülmesinde atılacak adımları belirlemek genetik tanımlama işlemlerinin kullanım alanlarından örnekler vermek üzere yapılan bu çalışmada. Zeytincilik Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü (Bornova, İzmir), bahçesinde bulunan morfolojik tanımlaması yapılmış olan bazı standart çeşitlerimizin RAPD-PCR yöntemi ile genetik polimorfizmi belirlenmiş, morfolojik tanımlamalarına yer verilmiş ve aynı zamanda meyvenin biyoloj ik (yağ asitleri kompozisyonu) özellikleri tanımlanmıştır.
MATERYAL ve METOD: RAPD-PCR analizleri: Çalışma, zeytin yapraklarından elde edilen DNA ve dekamer oligonükleotidler kullanılarak, DNA çoğaltma işlemi esasına dayanan RAPD-PCR yöntemi ile yapılmıştır. DNA ekstraksiyonu: Toplam DNA ekstraksiyonu taze zeytin yapraklarından, biraz değiştirilen CTAB metodu (Doyle ve Doyle, 1987) uygulanarak yapılmıştır. Gaz kromatografisi yöntemi ile zeytinyağında
yağ asidi dağılımı: Çalışmada, zeytin tanelerinin ezilmesi sureti ile çıkarılan yağ, esterleştirilerek Yağ asidi metilester haline getirilmiş ve Gaz kromatografisi yöntemi ile analiz edilmiştir (Boas ve ark., 1994).
SONUÇ ve ÖNERİLER: RAPD-PCR yöntemi ve kullanılan Operon primerleri ile zeytin yapraklarından izole edilen DNA numunelerinden, farklı boyutlardaki DNA fragmentlerini çoğaltmak mümkün olmuştur. Bu çalışmada, tekrarlanabilir fragment sayısı 1 ile 5 arasında değişmektedir. Bazı numunelere ait RAPD-PCR çalışmalarının çelişkili sonuçlar verebildiği ve tekrarlanması gerektiği gözlenmiştir. İzole edilen DNA numunelerinin kalitesinin zamanla düştüğü ve çelişkili sonuçların kaynağı olabildiği dikkat çekmiştir. Bu nedenle çalışmalar yeni izole edilmiş DNA ile yapılmalı ve aynı zamanda ve aynı deney koşullarında yapılan çalışmalara ait veriler değerlendirmeye alınmalıdır. Deneylerde kullanılan çeşitli kombinasyonlardaki primer setlerinin seçimi genetik yakınlık tablolarını etkilemektedir. Farklı primer setleri ile elde edilen verilerin kullanılması analiz edilen zeytin çeşitlerinin dendrogramdaki yerlerini değiştirebilmektedir. RAPD-PCR çalışmaları bu teknik sınırlamalar dikkate alınarak yürütülmeli ve değerlendirilmelidir. Bu çalışma, mevcut zeytin çeşitlerini az sayıda primer kullanarak karşılaştıracak, dolayısı ile farklılıklarını gösterebilecek şekilde düzenlenmiştir. Popülasyon genetiği çalışması adı verilebilecek bir çalışma daha fazla primer (lokus) ve AFLP gibi ilave moleküler teknikler kullanılarak yapılmalıdır. Zeytin bitkisinin olukça polimorfik olduğu belirtilmektedir. Seçilen bir kaç primer ile türler arasındaki farklılığı göstermek mümkün olmuştur. Bu farklılık koleksiyon bahçesinden alman standart zeytin çeşitlerinde daha belirgindir. Bu çalışmada zeytinlerin yetiştiği coğrafi bölgeler ile yakınlık dereceleri arasında bir ilişki tespit edilememiştir. Bu durum başka araştırıcılar tarafından da gösterilmiştir (Fabbri ve ark., 1995). Bu farklılıklar kesin olarak bir özellik ile ilişküendirilemese de RAPD-PCR yöntemi, zeytin aşılanmasında, farklı türlerin oluşturulmasında yapılan işlemin zeytin DNA'sma yaptığı değişikliklerin bir göstergesi, bir takip metodu olarak kullanılabilir. Farklı zeytin tiplerinin karakterizasyonu için morfolojik özellikler önemli faktörlerdir. İklim ve çevre koşulları göz önüne alındığında morfolojik özelliklerin buna göre değişebileceği düşünülmelidir. Bu nedenle biyometrik çalışmaların sağlıklı sonuç verebilmesi için uzun zamana ihtiyaç vardır. Sonuçları İklim ve çevre koşullarından etkilenmeyen RAPD-PCR yöntemi burada hızlı bir alternatif sunmaktadır.
Sonuç olarak bu çalışma yerine daha kesin sonuç veren yeni yöntemler kullanılarak milli koleksiyonumuzdaki zeytin tip ve çeşitlerinin özelliklerinin çıkartılması gerekmektedir. Bu amaçla yürütülmekte olan veya yeni sunulan çalışmaların bir an evvel tamamlanması gerekmektedir. Şu hali ile bu çalışma ile elde edilen genetik verilerden çok biyolojik ve yağ asitleri yönünden farklılıklara bakarak sonuca varılabilir.